(一) 石蜡切片

　　石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法 。

　　最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察;

　　石蜡块还能长期存档，供回顾研究。

　　石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改

　　善，因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。

　　1.取材的特殊要求及注意事项

　　*标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原

　　或变性消失，或严重弥散。

　　*取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。

　　*-细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。

　　2.取材的特殊要求及注意事项(续)

　　*避免挤压：取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色，因

　　而取材时应使用锋利的刀刃，镊取组织动作要轻;经窥镜直接钳取的组织往往有

　　过度挤压，观察结果时应有所考虑。

　　3.固定及常用的固定液

　　*取材后的组织需立刻投于固定剂中

　　固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态;对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。

　　*常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。

　　-醛类(常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛)

　　-醇类(常用乙醇)

　　-其它 (丙酮)

　　(1) 醛类

　　*甲醛(福尔马林)应用最广

　　-原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。

　　-优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。

　　-缺点：

　　*甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色;

　　*醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍;

　　*分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。

　　-注意事项：

　　*缩短固定时间，降低固定温度(4°C)，为此组织块不宜过厚。

　　*改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10%甲醛固定液，减少固定液pH的变化。

　　*固定后充分水洗以减少分子间交联。

　　*切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。

　　*戊二醛：

　　-穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。

　　*多聚甲醛(常用4%)：

　　-可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光染色。

　　*主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。

　　(2) 醇类

　　* 最常用的醇类固定剂是乙醇。

　　-其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。

　　-优点：穿透性强、抗原性保存好。

　　-缺点：

　　*脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。

　　*乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解;染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。

　　(3) 其它固定剂

　　*丙酮：

　　-对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。

　　(二) 冰冻切片

　　*冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接切片。

　　*在切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程。

　　-缩短了制片时间

　　-抗原性不受损失

　　*对稳定性差的抗原，如淋巴细胞表面抗原尤其适合。

　　*组织冻结过程中，细胞内、外的水分会形成冰晶，冻结的速度愈慢，冰晶颗粒愈大，可严重影响组织、细胞的形态结构。因此制备冻块时要求低温、速冻。

　　1、冰冻组织块的常用方法

　　*液氮中冰冻：组织投入液氮中 C)10-20sec。°(-196

　　C°*干冰中加入丙酮(或异戊烷)，液体立即气化起泡，温度降至-70 ，将组织投入，若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容器，组织投入该容器内结冻则更好。

　　-上述组织在速冻时应浸埋于OCT包埋剂或甲基纤维素糊状液内，以保护组织。

　　C冰箱。 °-制成冻块后若需保存，应以铝箔或塑料薄膜封包，贮存于-70

　　2、切片

　　*供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整，并有连续性。

　　*载玻片也应清洁无油污，但一般无需涂抹粘附剂;

　　mmC，切片厚度一般为4～8°*切片时，使用恒温冷冻切片机，在箱内温度-25

　　3、切片后处理

　　C丙酮固定10min，待干燥后作免疫组化染色或封存于-20℃。°*切好的冰冻切片，室温下自然晾干1～2h后，放入4

　　*冰冻切片由于切片技术要求较高，不易得到连续性很好的切片，其形态结构亦不如石蜡片，且冻块和切片不便于长期贮存，因此冰冻切片的应用受限。

　　(三) 组织印片

　　*将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面，细胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min，自然干燥后染片或-20℃保存。

　　(四) 细胞培养片(细胞爬片)

　　*贴壁细胞培养，置盖片于培养瓶中，使细胞在盖片上生长，达适当密度后取出固定(丙酮-20℃固定10～20min)，再进行免疫染色。

　　-盖片的处理方法同载玻片的处理，但泡酸时间2h即可。

　　-为了防止细胞脱片，可用多聚赖氨酸处理。

　　(五) 细胞涂片

　　*大多数细胞涂片由细胞悬液制成，包括：

　　-血液、尿液、脑脊液;

　　-体腔积液;

　　-组织穿刺吸取，如骨髓、淋巴结或其他实质性组织

　　-悬浮培养的细胞或贴壁细胞经消化后形成的悬液。