一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好

　　在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。

　　二、组织脱水必须彻底干净

　　组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。

　　三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折

　　应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，　不平。如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引走混淆。

　　四、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂

　　免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入了-氨基-三乙氧基-硅烷(3-Aminopropyl triethoxy-silane)的稀释液(1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以)中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。

　　五、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原

　　应用于免疫组化染色的切片。由于整个过程需经几个阶段的处理，如抗原修复时抗原修复液的沸腾且需持续十几分钟，PBS的反复冲洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育达十几小时。因此，对切片的质量要求很高，尤其是切片的附贴程度。以往有人主张切片在60℃以下烘烤30-60分钟即可按此进行结果是切片掉片严重，切片松动率占100%。切片究竟烘烤多长时间才合适，既不脱片和适合各项要求，又不至于破坏抗原。几组实验[]诊断P173认为，切片在60℃的恒温干燥箱中烘烤2-5小时最为合适。这是因为：抗原可耐受如此的温度，病理科一般使用的石蜡，其熔点在60℃左右，组织浸蜡时，浸蜡箱中的温度，一般都调在65℃左右，组织在这样温度中要浸泡2小时以上，才能达到彻底地浸蜡。组织中的抗原已经受了65℃的温度考验，保存下来的抗原，都已具有耐热性。另外，经上述时间烘烤出来的切片，附贴牢固，抗原保存好，染色成功率达100%，保证了病理诊断的及时性和准确性。

　　特需要注意的是，不管是应用于诊断的切片还是研究用的切片，烘烤后应尽快进行染色。如果切片切完后，迟迟不进行染色，存放于室温中或工作冰箱中，切片中的抗原将会随着时间的延长而逐渐消失，甚至出现假阴性。原则上是新鲜切片，即行染色，染多少张切多少张，这样才能尽可能的保存表达更多的抗原。

　　六、切片脱蜡必须干净，否则将会影响免疫组化染色的最后结果

　　蜡不溶于水，不与其它的临床使用的抗体相融合。它只能靠特用的试剂，处理足够的时间，才能将其除去。如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起许多弊病，如染色不均匀，阳性物时隐时现，真假难辨，背景染色增加等。为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短。较受使用者的青睐。脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜谋面是在不同。如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长。总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决定，脱蜡的时间，原则上是要彻底，干净，完全地脱去切片上的蜡。为了做到这一步，切片在脱蜡前的加温将有助于完成上述的要求。比如：当天切的切片，烧烤2小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温10-20分钟，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果魁伟更好。

　　七、必须彻底抑制内源性过氧化物酶的活性，才能降低背景的染色

　　在各种组织中都含有很多的内源性过氧化物酶，尤其在红细胞，中性粒细胞，单核细胞嗜酸性细胞，出血的组织坏死的组织等等。含有这种酶的各细胞和组织如果在染色前不对其进行处理和抑制，它们将会在DAB底物的显色时，与HRP一样催化底样，使之显色，使之生成与阳性物一样的黄棕色，造成混乱。为止，在免疫组化染色前，都必须对内源性过氧化物酶进行抑制。当然，对它们进行彻底的消除是不行的，因为抑制太厉害，对抗原也会有相同的抑制作用。氢在抑制内源性过氧化物酶时，也要注意对抗原的保护抑制也只能对它们中的大部分在DAB显色后，显示出淡黄*色，这就足以与真正阳性物的区别。抑制剂常用的是0.3%的H2O2，也可将其称为1%H2O2，因为市售的H2O2的浓度为30%，按其净含量则为0.3%，如果按其溶液的用量则为1%。

　　关于H2O2的使用，有的使用是单纯的H2O2稀释溶，有的使用是H2O2甲醇混合　物。根据实验，认为H2O2甲醇较适合于大多数的情况，因为除了H2O2外，甲醇对各种酶，都有钝化的作用，因此H2O2甲醇的双重作用效果较好。陈尚平等认为在多数情况中，用甲醇H2O2已经获得令人满意的结果。

　　八、须适当合理地使用封闭试剂

　　为了减少背景产生的非特异性染色，在免疫组化染色的过程中，在加入一抗孵育前，常常加入非免疫动物血清，以减少背景的染色，陈尚季等认为：抗体是高度的电荷分子，可能与带有相应电荷的组织成分无特异性地结合(如胶原)。由于这种非特异性结合，将导致标记的部分局部化(轭合物)和胶原的假阳性染色。要用一种不相干的抗体居先处理，可能减少和标记的抗体无特异性结合。

　　以往，血清的使用有很多，如：小牛血清，马血清，山羊血清，绵羊血清，兔血清，浓度也有很多种，如：1%.2%.或1：5、1：10、和1:20.

　　必须选择合适的抗体以及对作适当的保存和配制。

　　九、选择合适的抗体

　　至今为止，应用于临床的常用抗体有几十种，在这当中又可分为两种类型。

　　1.浓缩型抗体

　　根据近几年来使用的情况认为，它有许多优点，但也有许多不足之处：

　　①可作为各种疾病检测的常备抗体。在各单位的常规活检诊断中，有常见的病例，也有罕见的病例，尤其是后者，有时很长时间才遇到一例，这就给抗体的应用和备用提出了更高的要求，如除了常用的抗体外，还需备用一些较为罕见病例的抗体。这样才能解决临床的诊断问题，如临时购买，则需较长的时间，这样就会延误诊断。实践证明：浓缩型抗体，可作为常备检测抗体。当购买抗体后，根据检测病例的数量，在无菌的条件下，将抗体分成小包装，然后用蜡膜封起来，于-30℃的低温冰箱中保存，临用时取出一支，用指温促其回升至室温，然后用PBS稀释即可使用，这种抗体可保存3年左右。

　　②成本低，价格较便宜。

　　它与即用型的抗体相比较，价格要便宜好多，如以某公司2002年-2003年的CK为例，浓缩型的抗体0.1ml，价格260元，该抗体可稀释为5000ml，以每张切片所需抗体为50ul计，可标记100例，每例一抗体所需2.6元，而即用型抗体1.5ml，价格150元，可标记30例，每例一抗体需5元。

　　③需要稀释抗体，手续较为复杂。　　对于新购入的浓缩型的抗体，使用时必须将稀释为工作液，才能使用，对于从未用过的抗体，还必须实验其实际的稀释度，因为各种抗体，厂家都做了相应的稀释度的实验，但这是大概的稀释度，要使抗体真正适合于本单位的稀释度，就必须对抗体的稀释度进行实验，如1:100.1:75.1:50.1:25等，如果结果在1：50上是最佳结果，这就是最佳的稀释点，如果在这范围内找不出最佳稀释点，则应继续实验直到找出最佳稀释点为止。

　　④需要配置各型号的微量加样器，以利于量取精确的抗体量。

　　⑤需要具备一定的英语水平，因为浓缩型的抗体多为进口试剂，其使用书都以英文为主，其中涉入抗体的来源，适应让稀释对什么组织或细胞可起反应等。

　　2.即用型抗体

　　近几年来，免疫组化技术应用的推广，即用型抗体的应用越来越受到人们的欢迎，根据几年来的使用，认为它有许多优点和不足：

　　①使用方便。对于初学者来说，它是一种最好的抗体，不管什么样的病例和切片，只要有抗体，不需要自己摸索稀释度，拿起试剂瓶一滴即可，极不方便。

　　②对于不具备或基本不懂免疫组化技术的人，只要按照说明书的方法使用，也能获得理想的结果。

　　③不需要配置多种昂贵的微量加样器。现今的微量加样器，如为进口货，贵者多达两千多元。而即用型抗体无需再行稀释，即买即用，无需配备其余器械。

　　④特别适合于基层单位。基层单位，无需多大的投资，就能开展免疫组化的工作，这对于提高诊断的准确率，极有好处。

　　⑤价格较浓缩型抗体贵。

　　⑥即用型抗体不可作为常备贮存抗体。即用型抗体，一般有效期为一年。如果用量大的单位，对于3ml一个包装的抗体，一年需要用几支，这对抗体来说，不会造成浪费。但如果为较小的单位，一年中标记的病例较少，购买抗体时也尽量选小包装的抗体，如1.5ml。如果碰上罕见的病例，有时一年也标记不了几例，这样就应采用浓缩的了。即用型的抗体，有效期为一年，但真正购买到的抗体使用期就不可能为一年，因为抗体从生产商到销售商的手里，需要一定的时间，如果运气好的话，你购买到的抗体，是刚交到销售商的手里，那么，使用的时间可能长些，但如果在销售商的手中滞留了一段时间，抗体的有效使用期就可能不会太长，五个月、六个月或者三个月。如果在有效的时间内不能使用完。稍为超过一些时间还可以，如果时间过长，就应当丢弃，因为会影响标记的质量。有人抱怨，刚买的抗体标记很好，后来就渐渐不好了。这是因为随着时间的延长，抗体的活性会逐渐失去生物活性，导致了标记质量的下降。

　　(1) 抗体的适应症。

　　在众多的抗体中，按它们的实际使用范围，把它们分为两个类：

　　1.适合于冰冻切片，涂片，细胞培养片。

　　2.适合于石蜡切片，冰冻切片，涂片和细胞培养片。

　　(2)选择合适的单克隆或多克隆抗体。

　　抗体除了分为上述的两个类外，从其克隆的高度讲，也有单克隆和多克隆之分。

　　1.单克隆抗体，在目前临床常用的抗体当中，大部分都是单克隆抗体。这要归功于生物技术的不断提高。在早些时候，应用于临床的抗体，大多数为多克隆抗体。

　　2.多克隆抗体，在临床应用的抗体中，还有少部分的抗体为多克隆抗体。

　　(3)抗体的加入。

　　这看似很简单的问题，如果处理不好也可导致不同的结果，如果应用自动免疫组织化学染色仪，将程序输入即可，如为手工操作，就必须注意以下的问题：

　　1.当PBS冲洗完毕后，在加入抗体，如一抗，二抗或三抗。必须将存留于切片上的多余的PBS摔干，但不能让切片干涸，切片干涸，往往可产生非特异性染色，切片上PBS存留过多，将会稀释加入的抗体，影响加入抗体的浓度，同时也将影响最后的结果，如假阴性等。

　　2.加入的抗体以一滴为佳。

　　当擦干组织块周边多余的PBS后，切片保持着一定的湿润度，此时加入另外的抗体为最佳时候，滴入抗体以一滴50ml为好，加入后，轻微地摇匀地覆盖于切片上，使最后的结果稳定均衡，不至于有的地方有反应，有的地方无反应。

　　3.切片没擦好将会影响加入抗体的质量，切片没冲洗干净，没擦试好，当加入抗体后，它可缩于切片的一边，此时你为了使加入的抗体能够完全地覆盖整个切片，便会使劲地加入抗体，此时的结果是，抗体依然滑向一边，或者完全露出，这不光没达到目的，还浪费抗体，正确的做法就是彻底地用PBS冲洗，摔干切片擦干切片周边的PBS，再滴入一滴抗体轻轻摇匀即可。

　　(4)选择合适的孵育时间。

　　第一抗体的孵育时间，有较多的使用范围，应用于临床检测抗体的孵育时间。一般室温下孵育在30-60分钟，120分钟，对于研究性质的抗体孵育时间，也可按照上述的时间，但也有人提出于4℃冰箱中过夜孵育，根据我们的经验一般不主张于4℃冰箱中过夜，原因是：

　　1.长时间的孵育可以使一些非特异性的物质沉淀下来，或者被吸附，造成背景的染色。

　　2.目前销售的抗体，纯度较高，特异性较强，不需要长时间的孵育，也能够结合得很好　。

　　3.长时间的孵育，较容易引起切片的脱落，造成染色的失败。

　　4.长时间的孵育，不利于临床病理报告的发出。

　　十、连接抗体的选用必须正确，否则可造成假阴性的现象

　　免疫组化染色方法较多，如ABC法，SP法和EV二步法等，如果使用的是SP法，或者ABC法，这时就必须要仔细地选择好连接抗体，第一抗体有单克和多克隆炎分，连接抗体则要根据选用的抗体来进行，例如：第一抗体选用的是单克隆鼠抗人**抗体，连接抗体也要选择相应的免抗鼠IgG，这样才能连接上(目前生产厂家已生产出混合型抗体，即既适合于单克隆抗体，也适合于多克隆抗体。使用者不用担心连接不上，随便使用都可，但如果没有订购混合型的试剂盒，就必须注意的型号，使之完全适合所选用的抗体。)孵育的时间可在10分钟，20分钟或者30分钟，一般在室温中进行，如果室温低于20℃以下，则可在37℃的孵育箱中进行。

　　十一、复合物的使用及孵育时间的确定

　　各种方法有各自的复合物，如ABC法，复合物是卵白素和生物素结合的复合物，再带有HRP，SP法，(LsAB法)的复合物是链雪菌素蛋白复合物，再带有HRP，EV二步法的复合物则是二抗和三抗连接在一起的复合物，再带上HRP，除此之外，根据水解底物的不同，可产生不同的颜色，例如：带有HRP的酶，水解的底物一般为DAB产生黄棕色，带AP的酶，水解的底物一般为AEC产生红色。

　　十二、PBS的冲洗

　　免疫组化的染色过程，除了前面的处理和加入的抗体外，都在PBS的冲冲洗洗中度过，PBS冲洗的正确与否，也是导致最后结果的关键。

　　1.单独冲洗，防止交叉反应造成污染。

　　临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。

　　2.温柔冲洗，防止切片的脱落。

　　冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲出的PBS有一定的冲击力，很容易使切片周边引起松动，导致切片的脱落。

　　3.冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。

　　冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法一是浪费时间，二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入PBS，持续2分钟左右就完全足够了。

　　4.PBS的PH和离子强度的使用和要求。

　　刘彦仿指出：中性及弱硷性条件(PH7-8)有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。[]免疫组化P56我们目前常用的PBS的PH在7.4-7.6浓度是0.01M，根据本室十几年来的使用情况，认为该溶液价格便宜配制方面，使用效果好。

　　5.常用试剂的配制和使用。

　　在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中，抗体的加，换，切片的冲洗，DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱，都将影响染色的结果。下面将介绍有关方面的内容：

　　(1)缓冲液的配制

　　1.磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution.PBS)

　　Ⅰ液：0.2M　Na H2PO4贮存液(PH7.6)

　　取一个具500ml的容量瓶，称量15.60g NaH2PO4﹒12H2O倒入瓶中，加入少量蒸馏水使劲摇晃，直至溶解，加入蒸馏水凑足500ml。放于4　冰箱保存，配制时应注意的事项：

　　①在配制时，要先确定NaH2PO4的用量，因为该试剂有许多种类形，它们所含的水分子量不一样，因而它们的用量也不一样。如NaH2PO4含单个水分子时，配制时要称取13.80g，而当含有2个水分子时，则需要称取15.60g。

　　②配制时根据要求选取蒸馏水。因为蒸馏水有数种，单蒸馏水，双蒸馏水，玻璃蒸馏水，去离子水。如没特别要求，选用一般的蒸馏水配制则可。

　　③装缓冲液的瓶子须用玻璃浸洗液泡洗过，以防污染，导致溶液中有雪菌生长。

　　Ⅱ液：0.2M NaHPO4贮存液(HP7.6)

　　取500ml的容量瓶，称好17.91g NaHPO4﹒12H2O,倒入瓶中，边加水边搅拌，直至完全溶解再凑足500ml，贮存于4℃冰箱。

　　注意事项：

　　①该试剂也应注意有多种不同的含水分子量。

　　②该贮存液久放后可出现结晶。每次使用前，先取出回至室温，摇晃其结晶溶解，也可用微波炉促其快速溶解，然后再用。

　　0.01M PBS工作液的配制：

　　取一2000ml的容量瓶一个，装入已称好的NaCt18g，加入少量蒸馏水让其彻底溶解，再加入 Ⅰ液13ml，Ⅱ液87ml，加蒸馏水凑足2000ml，即可使用，即可使用该溶液在室温下可保存3-4周，但以新配为佳。

　　PBS工作液配制完毕后，都要测其PH值，如果偏酸，可用氢氧化钠来调试，如果偏碱可用HCl调试，测试有如下n种方法：

　　①PH测试笔测试，这是一种简便、易行、结果较为准确的测试方法。当配制完PBS后，取一小杯，倒入配好的PBS，插入测试笔，打开开关，小屏幕上将可出现测出的PH结果。PH如果7.6不足，小量的可用0.2M Na2HPO4调校，大量的可用氢氧化钠调校。PH如果高于7.6，小量的用0.2M NaH2PO4调校，大量的可用HCL来调校。

　　②用试纸来测试：PH试纸有两种，一种为广泛PH试纸，范围在1-14，另一种是精密试纸有各种各样的范围。但是，作为冲洗切片用的PBS，其精确度不需要十分精确，如配PH7.6时，测试时在PH7.5或7.7，都可使用。试纸测试PH值，停靠其反应的颜色来确定，十分简便，一般的试剂都可用它来测试。

　　③仪器测试：对于要求较高，需较准确的PH值，须彩用仪器测试。

　　1.Tris缓冲溶液(Tris buffer solution,TBS)

　　①1N HCL ，浓HCL(双重1.19)8.3ml，先取50ml蒸馏水，加入HCL再加水到100ml。

　　②0.5M Tris-HCL缓冲液(PH7.6)

　　取Tris(羟甲基氨基甲烷)6.57g，加入少许的蒸馏水搅拌，直至溶解，再加入1N HCL42ml，然后用蒸馏水凑足100ml，于4℃冰箱保存。

　　临用时，将上述溶液10稀释倍，即为0.05M工作液。

　　注意事项：

　　①配制1N HCL时，如果大量配制，HCL入水时可产生很大的热量，对的所用的玻璃器皿应特别小心，以防突然产热而使玻璃器皿爆裂。

　　②调校PH值时，可参考上述的三种方法

　　免疫组化实验结果的判定和分析

　　就实验结果而言，免疫组化技术服务主要涉及抗体实验结果的描述与分析、图片的确定与选取、相关数据的提供，上述工作是免疫组化工作的重点内容。只有严格的实验设计、标准的实验操作、专业化的结果分析才能满足客户的要求，更好地为客户提供最优质的服务。

　　免疫组化结果的判定原则：

　　⒈必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。

　　⒉抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上;CK应定位在细胞浆内;PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内;EMA应定位在细胞膜上等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。

　　⒊阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。

　　⒋尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。

　　⒌对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应结合临床资料、X线等影像学及实验结果综合分析。

　　对照染色设计：

　　(一)对照染色的目的

　　设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。假阴性的原因主要有三种：

　　① 组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽;

　　② 抗体失活、效价过低或稀释度不合适(主要指一抗，即特异性抗体);

　　③ 染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液pH和离子强度不当等。

　　假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有：

　　① 自发荧光或内源酶等干扰;

　　② 抗体试剂不纯(特别是一抗);

　　③ 操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等;

　　④ Fc受体的干扰，等等。

　　(二)对照的种类及其选用目的

　　对照染色大致可分为四类：即阳性组织对照、阴性组织和阴性试剂对照及自身对照。

　　⒈阳性组织对照

　　指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。正确的结果应呈现阳性，目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。

　　⒉阴性组织对照

　　指用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照。正确的结果应为阴性，目的是除外假阳性。

　　⒊阴性试剂对照

　　是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性而所设立的同步免疫染色对照，包括有：空白对照、替代对照、吸收试验和抑制试验等。目的在于除外假阳性和证实所用免疫组化试剂及其技术方法的有效性和待检实验切片免疫标记阳性结果的可靠性。

　　⑴ 空白对照

　　指以缓冲液(PBS、TBS等)取代第一抗体(主要的，必要时还可做第二抗体及桥联抗体的空白取代)，其他各步不变的试剂对照染色，结果应为阴性。

　　⑵ 取代对照

　　指以所用方法第一抗体同源动物的正常血清，或与本实验无关的抗体(靶生物缺如的)取代第一抗体，其他步骤不变的试剂对照染色，结果应为阴性。

　　⑶ 吸收试验

　　是指用事先经过量抗原吸收的第一抗体上清液取代第一抗体，其他步骤不变的免疫染色试剂对照。结果应是阴性或阳性着色明显减弱(吸收不全时)。

　　⑷ 抑制试验

　　是指用标记抗体和未标记抗体(可以是一抗，也可以是二抗或桥抗体)两者的混合物作试剂，其他步骤不变的免疫组化染色试剂对照，结果其阳性着色应成比例的减弱(等量或1：9)。此试剂对照多用于直接法。

　　这类阴性试剂对照的选用原则是：

　　① 空白对照不能省，其他对照在预实验中应多做，尤其是应用新抗体试剂;

　　② 对照必需与实验片同步进行染色;

　　③ 对照的结果应附合要求。

　　⒋自身对照

　　是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。即与靶抗原阳性反应细胞或成分相邻的阴性背景结构的显色，结果应为阴性或着色较浅，需与阳性着色成分呈鲜明对比。目的在于排除内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果。

　　非特异性染色：

　　非特异染色是指免疫组化染色过程中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳性，又称背景着色，能严重干扰免疫组化染色结果的正确判断，应竭力避免或减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的各个环节，可来自：

　　① 内源性干扰(自发荧光、内源酶、内源性生物素等);

　　② 试剂污染(质量差，交叉反应，Fc受体干扰等);

　　③ 组织处理不当(组织固定不及时或固定不良所导致的抗原弥散移位、洗涤不充分所导致的游离试剂残留等)。

　　纠正的方法视原因而异，可在预实验基础上，采用有针对性的纠正对策，即对症下药。

　　阳性标记的形态特征和判断：

　　免疫组化标记具有一定形态特点，若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记结果的正确判断。特点包括定性、定位和定量三方面。

　　免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量，与抗原含量有关;阳性细胞的着色形态及组织分布特点主要是定位指标，与功能有关。

　　一、阳性标记免疫特征

　　分"弱(+)、中(++)、强(+++)"三级。免疫荧光法(FITC为例)则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光;

　　免疫酶标记(HRP- DAB/H2O2)则表现为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒，后者耀眼易见。一般图片照像，原则上多取强阳性区域。

　　二、阳性标记细胞学特征(以HRP-DAB/H2O2为例)

　　可分为①胞膜型;②胞核型;③胞质(浆)型;④微绒毛型和⑤复合型(胞膜-胞质兼有，胞核-胞质兼有，或微绒毛-胞质兼有)等五种阳性细胞类型。这与抗原所在部位相关联，但应注意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假象，尤其是复合型图像。

　　三、阳性标记组织学特征(以HRP-DAB/H2O2为例)

　　免疫组化染色阳性细胞在组织中的分布排列形式可以有如下7种：①局灶型;②弥漫型;③片块型;④网状型;⑤腺管型;⑥腔缘型和⑦菊团型等。这主要取决抗原抗体复合物在细胞内的分布和阳性细胞在组织内的群体分布特点。

　　四、阳性标记强度特征

　　依照细胞阳性着色程度(抗原含量)，可分为：

　　弱阳性(+)┅1分;

　　中等阳性(++)┅2分;

　　强阳性(+++)┅3分。

　　依照阳性细胞数量，可分为：

　　弱阳性(+ ，指阳性细胞总数在25%以下);

　　中等阳性(++,指阳性细胞总数在25%—49%);

　　强阳性(+++ ，指阳性细胞总数在50%以上)。

　　目前多采用积分综合计量。计算公式为：(+)%x1 +(++)%x2+(+++)%x3;总数值<1.0者为(+)，1.0-1.5者为(++),>1.5者为(+++)。至少随机观察5-10个HPF。

　　染色失败的可能原因

　　免疫组化染色的基本要求有二：

　　① 实验切片的阳性抗原定位准确，呈色鲜明，背景着色浅或无，二者的比值应大于1(阳性/背景);

　　② 对照染色的结果应附合要求。否则，所得实验结果都是错误的，或为假阳性或为假阴性。

　　假阳性是指实验切片呈阳性，阴性组织对照或阴性试剂对照也呈阳性的结果，谓之假阳性。其原因与内源性干扰，试剂不纯，交叉反应等有关。

　　假阴性是指实验切片呈阴性，阳性组织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果，谓之假阴性。其原因与组织处理不当，组织细胞抗原丢失或试剂错误(如漏加、错加、失效、变质等)，操作失误等有关。

　　对照结果判断：

　　阳性对照阴性对照替代对照检测结果结果判断

　　1(-)(-)(-)(-)抗体失活，操作有误

　　2(+)(+)(+)(+)非特异性染色

　　3(+)(+)(-)(+)(-)阴性对照内含定位抗原

　　4(-)(-)(-)(+)阳性对照不含定位抗原

　　5(+)(-)(+)(+)非特异性染色

　　6(+)(-)(-)(-)检测标本不含抗体，结果可靠

　　7(+)(-)(-)(+)检测标本含抗体，结果可靠

　　表中1-5结果可靠，6、7结果可靠

　　染色失败原因：

　　均为阴性

　　均为弱阳性(除阴性对照)

　　背景染色过深

　　阳性对照好，待检标本弱阳性

　　阳性对照无背景，待检标本背景深

　　判断原则：

　　实验设计

　　抗体选择

　　抗原定位性

　　抗原分布不均一性

　　识别假阴性

　　抗原丢失或减弱

　　抗体失活

　　操作不当

　　识别假阳性

　　抗原弥散

　　抗原异位表达

　　瘤细胞吞噬

　　病变中正常组织残留

　　抗体交叉反应

　　内源性物质着色

　　边缘反应、刀痕、皱折、坏死或挤压区域不作为判断依据，应用“ 正反法”。原 则

　　免疫组化标准化：

　　抗原特异性

　　抗体交叉反应和标记谱系

　　方法规范化

　　结果综合分析和判断